Faits marquants

Faits marquants

Les faits marquants 2022 de l'unité BREED

Les faits marquants scientifiques

Comment l'analyse du génome de patients avec azospermie pourrait changer leur prise en charge clinique ? (RHUMA et DGP)

Résumé

L’azoospermie, définie comme l’absence de spermatozoïde dans l’éjaculat, concerne 1% des hommes. L’avènement récent des technologies de séquençage haut débit a permis l’identification de nouvelles causes génétiques et d’améliorer le rendement du diagnostic génétique dans ce phénotype. Le but principal de cette étude a été de montrer comment le séquençage exomique, chez des patients avec un blocage de la spermatogenèse par arrêt méiotique (AM), pourrait modifier la prise en charge. Le séquençage exonique sur une cohorte de 26 individus, non apparentés présentant un AM, identifie une altération de gènes de la méiose chez 58% de ces patients, et chez 100% si on ne considère que les patients issus de parents consanguins. Les analyses démontrent l’hétérogénéité génétique du phénotype d’AM complet.

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Contexte et enjeux

L’azoospermie constitue la forme extrême d’infertilité masculine en raison de l’absence de spermatozoïdes dans l’éjaculat. Afin de répondre au désir de parentalité des couples, il est nécessaire d’avoir recours à une biopsie testiculaire pour retrouver des spermatozoïdes utilisables dans un second temps lors d’une fécondation in vitro avec micro-injection intra cytoplasmique(ICSI). Or, ce geste chirurgical est invasif avec un potentiel effet délétère à long terme suite à un déficit en testostérone. Si les chances de retrouver des spermatozoïdes sont élevées et proches de 95% en cas d’anomalie des voies différentielles, celles-ci sont dramatiquement diminuées, autour de40% si le défaut est testiculaire. Or, il n’existe pas aujourd’hui de critères cliniques et/ou biologique permettant d’évaluer les chances de retrouver des spermatozoïdes dans cette dernière situation.

Résultats

Notre étude parue dans Human Reproduction a évalué la pertinence de l’analyse de la séquence exonique (Whole Exome Sequencing: WES) chez des patients où une première biopsie testiculaire montrait un blocage homogène de la maturation spermatique au cours de la méiose I.La collaboration de chercheurs de l’unité BREED (Dépt Phase, Jouy-en-Josas) et du Département de Génétique, Laboratoire de Biologie Médicale du CHI de Poissy/Saint-Germain-en-Laye (Poissy) a pu démontrer, après validation par immunohistochimie, que cette approche était plus pertinente que l’approche de séquençage ciblé (Target Sequencing: TS) avec, chez plus de50% des patients et 100% des patients consanguins, une cause génétique identifiée expliquant le phénotype testiculaire.

Perspectives

Ces résultats préliminaires ont montré que cette analyse permet d'apporter des arguments afin de ne pas réaliser une deuxième biopsie testiculaire chez ces patients, voir même en première intention chez des patients consanguins, et ceci malgré les problèmes d’interprétation et découvertes dites fortuites générées par cette analyse.

Valorisation

Poursuite de ces travaux grâce à l'obtention de l'ANR-MEIOBLOC (2023-26)

Références bibliographiques

Ghieh F, Barbotin AL, Swierkowski-Blanchard N, Leroy C, Fortemps J, Gerault C, Hue C, Mambu Mambueni H,JaillardS, Albert M, Bailly M, Izard V, Molina-Gomes D, Marcelli F, Prasivoravong J, Serazin V, Dieudonne MN,Delcroix M, Garchon HJ, Louboutin A,Mandon-Pepin B, Ferlicot S,Vialard F.

Whole-exome sequencing in patients with maturation arrest: a potential additional diagnostic tool for preventionof recurrent negative testicular sperm extraction outcomes.Hum Reprod. 2022 May 30;37(6):1334-1350. doi:10.1093/humrep/deac057. PMID: 35413094; PMCID: PMC9156845.
Partie de la thèse de Farah Ghieh:Les arrêts méiotiques: de l’identification des défauts génétiques à l’approche thérapeutique. https://www.theses.fr/2021UPASL103

L'hétérochromatine de l'embryon précoce présente un profil épigénétique qui lui est singulier (EPEE)

Résumé

L’ADN dans les noyaux est empaqueté et compacté grâce à différentes protéines, l’ensemble étant appelé chromatine. Elle est constitué de différents compartiments en fonction de l’activité des gènes sous-jacents. Nous nous intéressons à l’hétérochromatine constitutive, qui se forme autour de séquences répétées et dont le maintien compacté est essentiel à l’intégrité de l’ADN. Nous avons analysé, dans l’embryon de souris, l’évolution du profil épigénétique de ce compartiment particulier, tout au long du développement pré- et péri-implantation, notamment au moment où apparaissent les cellules pluripotentes à l’origine du fœtus proprement dit. L’étude montre que cette région d’hétérochromatine se réorganise selon une séquence d’évènements très finement orchestrés, et met en oeuvre une marque épigénétique particulière sur un histone, H3K27me3.

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Contexte et enjeux

A la suite de la fécondation, le génome embryonnaire subit différents remodelages épigénétiques et structuraux, nécessaires à son activation. Ces différents remaniements se poursuivent tout au long du développement, alors que l’embryon progresse de l’état de totipotence vers la pluripotence et la différentiation. Nous nous attachons à mieux comprendre comment ces évènements se déroulent et comment ils sont contrôlés.

Résultats

Suite à des résultats précédents obtenus in vitro sur des lignées de cellules pluripotentes, nous avons analysé le profil de la marque d’histone H3K27me3 au niveau de l’hétérochromatine constitutive. Ainsi la modification post-traductionnelle d’histone 3K27me3 est enrichi au niveau des régions d’hétérochromatine péricentromérique lorsque la méthylation de l’ADN est au plus bas, puis disparait peu avant que cette méthylation réapparaisse. De façon intéressante, ces cinétiques diffèrent selon le lignage considéré, pluripotent (fœtus) ou extra-embryonnaires (futur placenta ou sac vitellin). La comparaison avec les cellules souches représentatives de ces différents lignages montre une conservation imparfaite de cette particularité épigénétique de l’hétérochromatine péricentromérique. En conclusion cette étude montre que la localisation de H3K27me3 au niveau l’hétérochromatine péricentromérique est une caractéristique spécifique du développement embryonnaire précoce.

Perspectives

Cette marque d’histone est également présente au niveau de ce même compartiment d’hétérochromatine dans l’embryon de bovin ce qui suggèrerait un rôle conservé de cette marque épigénétique dans le développement embryonnaire.

Valorisation

Valorisation : Pailles, M.; Hirlemann, M.; Brochard, V.; Chebrout, M.; Oudin, J.-F.; Marks, H.; Jouneau, A.; Bonnet-Garnier, A. H3K27me3 at Pericentromeric Heterochromatin Is a Defining Feature of the Early Mouse Blastocyst. Sci Rep 2022, 12 (1), 13908

 

  • Le point sur l'expression des gènes et le développement placentaire chez l'équin (PEPPS)

Résumé
Très récemment, des progrès importants ont été faits dans la connaissance du développement physiologique du placenta chez l'équin et des réponses physiologiques à un environnement maternel perturbé, en particulier par des études d'expression de gènes, mais aussi par des analyses physiologiques (histologie, endocrinologie). Ces travaux ont été menés par trois équipes, l'une aux États-Unis, une autre en Angleterre et l'unité BREED. Nous avons collaboré ensemble pour rédiger trois publications synthétiques présentant l'état actuel des connaissances sur le placenta équin et mis en relation les stades de développement fœtal et placentaire. Ces revues sont une source unique d'information pour tous les chercheurs s'intéressant à la gestation et aux Origines Développementales de la Santé et des Maladies (DOHaD) chez les équidés.

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Développement comparatif du placenta et du fœtus chez l'équidé à partir de 28 j de gestation
 

Contexte et enjeux:
Le développement placentaire équin est un long processus aux caractéristiques uniques. L'implantation se produit vers 40 jours de gestation avec la présence d'un placenta invasif transitoire de 25-35 à 100-120 jours. Le placenta définitif, diffus et épithéliochorial, demeure jusqu'au terme (330 jours). Le développement initial et la fonction ultérieure des membranes fœtales du placenta équin nécessitent une régulation à la fois complexe et précise de l'expression génétique. Les progrès réalisés ces dernières années dans les techniques bioinformatiques ont permis des analyses approfondies de l'expression des gènes. De plus, le développement placentaire dépend de l'environnement maternel, qui peut être affecté par plusieurs facteurs (par exemple, la nutrition, le métabolisme, l'âge, les technologies embryonnaires, les pathologies) qui peuvent affecter le développement fœtal ainsi que la santé à long terme du poulain.

Résultats:
L'ensembles de données transcriptomiques disponibles obtenues à partir d'une gamme de tissus embryonnaires, placentaires et maternels a été étudiée afin d'obtenir un aperçu des familles de gènes clés pertinentes pour la placentation chez le cheval. Couvrant l'ensemble de la gestation, le travail a porté sur le trophectoderme, le sac vitellin, les cellules de la ceinture chorionique, l'allantoamnion et l'allantochorion. En particulier, 182 gènes prédits à fort impact précoce ont été identifiés (> 100 transcrits par million (TPM) et > 100 fold-change) qui distinguent le trophectoderme progéniteur, le tissu de la ceinture chorionique et l'allantochorion. En outre, 71 gènes ont été identifiés comme étant enrichis dans les tissus placentaires (TPM placentaire > 10, avec une expression minimale dans 12 TPM non placentaires < 1), y compris d'excellents candidats pour des études fonctionnelles tels que l'IGF1, les apolipoprotéines, VGLL1, GCM1, CDX2 et FABP4. L'environnement maternel et les pathologies de la reproduction affectent l'expression des gènes et la structure du trophoblaste/placenta. Jusqu'à présent, seules des données préimplantatoires et de fin de gestation/terme sont disponibles, qui démontrent une importante plasticité placentaire en réponse aux variations environnementales, avec des gènes impliqués dans le stress oxydatif et la différenciation tissulaire principalement impliqués dans la période préimplantatoire, alors que les gènes impliqués dans la croissance foeto-placentaire et les transferts de nutriments sont principalement perturbés à terme.

Perspectives:
Il est pertinent que les études futures se concentrent sur des approches transcriptomiques unicellulaires afin de déterminer comment ces changements dans l'expression des gènes sont liés à la composition du tissu et de commencer à mieux définir les sous-populations de trophoblastes dans le placenta équin. La caractérisation fonctionnelle future de ces gènes et de ces voies sera également essentielle non seulement pour comprendre le développement placentaire normal et la santé du fœtus, mais aussi leur rôle potentiel dans les pathologies de la gestation et la programmation de la santé des poulains.

Valorisation:
Trois publications

Références bibliographiques:
Robles, M., Loux, S.C., de Mestre, A.M. and Chavatte-Palmer, P. (2022) Environmental constraints and
pathologies that modulate equine placental genes and development. Reproduction .
https://rep.bioscientifica.com/view/journals/rep/aop/rep-21-0116/rep-21-0116.xml. Accessed January 30,
2022.
Loux, S.C., Robles, M., Chavatte-Palmer, P. and de Mestre, A.M. (2022) Markers of equine placental
differentiation: insights from gene expression studies. Reproduction .
https://rep.bioscientifica.com/view/journals/rep/aop/rep-21-0115/rep-21-0115.xml. Accessed January 30,
2022.
Chavatte-Palmer, P., Derisoud, E. and Robles, M. (2022) Pregnancy and placental development in horses: an
update. Domestic Animal Endocrinology 79, 106692

  • Développement de cultures in vitro de fragments d’organes fœtaux chez la brebis ; mise en évidence des effets toxiques du BPA sur les ovocytes. (DGP)

Résumé
Le Bisphénol A est un perturbateur endocrinien retrouvé dans de multiples fluides biologiques chez l’Homme et les animaux. Il est présent à faibles doses dans le sang de cordon et le liquide amniotique, ce qui entraine une exposition fœtale, notamment des ovaires et des ovocytes. Afin d’évaluer les effets du BPA au cours de l’organogénèse foetale, un modèle de culture in vitro de fragments d’ovaires fœtaux a été développé chez la brebis. Après validation du système, les effets d’une exposition au BPA (10-7 et 10-5M) pendant 20 jours ont été analysés. Il a été montré que l’effet majeur observé sur les ovocytes se produisait lors de l'initiation de leur division (méiose I). Trois voies sont altérées: le cycle cellulaire qui permet la transition mitose/méiose, le déroulement de la division de prophase I et l’assemblage du fuseau méiotique. L’exposition au BPA peut donc conduire à une altération de la réserve ovarienne en augmentant le nombre d’ovocytes défectueux, conduisant alors à une insuffisance ovarienne prématurée et une infertilité à l’âge adulte.

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Cultures in vitro de fragments d’ovaires fœtaux de brebis pendant 20 jours (55-75 jours post coitum), coupes histologiques montrant la progression de la prophase I de méiose dans les ovocytes.Auteur : Béatrice Mandon-Pépin
 

Contexte et enjeux:
Les perturbateurs endocriens présents dans l’environnement passent la barrière placentaire et font partie de l’exposome auquel les individus de nombreuses espèces sont soumises. L’impact sur les gamètes est important à déterminer car il conditionne la fertilité des individus et la santé de leur descendance. Le développement de système in vitro permet de limiter le nombre d’animaux utilisés en expérimentation et d’affiner les mécanismes moléculaires affectés par les divers produits chimiques.

Résultats:
Le système in vitro développé ici permet de cultiver les fragments d’ovaires fœtaux de brebis pendant 20 jours et ce modèle reproduit les étapes clés de la prophase I de méiose dans les ovogonies. Cette durée permet d’appréhender plusieurs mécanismes clefs de la différenciation des ovocytes fœtaux. La brebis, de part ses caractéristiques physiologiques proches de l’Homme est un modèle pertinent. Les analyses transcriptomiques réalisées après exposition à de faibles doses de BPA révèlent plusieurs voies de dérégulation qui vont conduire à la perte d’ovocytes dans les ovaires fœtaux. Rappelons que le stock d’ovocytes des femelles est constitué pendant la vie fœtale et ne sera pas renouvellé au cours de toute la vie reproductive.

Perspectives:
Ce système de culture in vitro permettra de tester d’autres composés chimiques présents dans l’environnement et d’analyser leurs effets sur la différenciation des ovaires fœtaux. Des mélanges pourront être ainsi testés sans multiplier le nombre d’animaux en expérimentation.

Valorisation:
Utilisation du système in vitro dans l’ANR MECABPA

Références bibliographiques:
Loup B, Poumerol E, Jouneau L, Fowler PA, Cotinot C, Mandon-Pépin B.
BPA disrupts meiosis I in oogonia by acting on pathways including cell cycle regulation, meiosis
initiation and spindle assembly. Reprod Toxicol. 2022 Jun 3;111:166-177.

  • Une signature épigénétique particulière dans les spermatozoïdes humains en fonction de leur morphologie à fort grossissement. (EPEE)

Résumé
L’hypercondensation de la chromatine décrite dans le spermatozoïde humain est déterminée par son épigénome. La présence de « vacuoles » céphaliques spermatiques sont le reflet de l’état de condensation de la chromatine spermatique. Cependant, on ne connaît pas la nature précise des vacuoles. L’objectif de cette étude est d’évaluer la présence de différentes modifications d’histones dans les spermatozoïdes en fonction de leur morphologie à fort grossissement. Pour cela, diverses modifications de l’histone H3 ou H4 ainsi que des protamines ont été comparées en termes d’incidence et de localisation (microscopie 3D) entre spermatozoïdes sans vacuoles et vacuolés. Les résultats indiquent que les spermatozoïdes vacuolés sont associés à un déficit de protamine P2 et H3K27me3, et à un excès d’histone H3 et H3K4me3. Par ailleurs, après microscopie optique à déconvolution et reconstruction en 3 dimensions, H3K4me3 a été retrouvé à l’intérieur de la vacuole. Ainsi, nous démontrons la nature nucléaire de cette vacuole et le maintien anormale d’une modification d’histone normalement associée à une chromatine peu condensée.

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Reconstruction 3D en microscopie optique à déconvolution d’un spermatozoïde de morphométrie normale avec présence d’une vacule (occupant plus de 15% de la surface de la tête), marqué par le DAPI (bleu) et l’anticorps anti-H3K4me3 (rouge) (Bendayan et al., 2022).La flèche blanche montre la présence de la marque H3K4me3 au sein de la vacuole.(A) Schéma du plan supérieur (a), du plan frontal (b) et d'une coupe transversale (c) du spermatozoïde. (B) Le spermatozoïde visualisé avec un contraste interférentiel différentiel (DIC). Images reconstruites en trois dimensions du spermatozoïde avec (C) marquage DAPI, (D) marquage H3K4me3, et (E-G) marquage DAPI/H3K4me3. DAPI : 4ʹ,6-diamino-2-phénylindole
 

Contexte et enjeux:
En Assistance Médicale à la Procréation, l’observation à fort grossissement des spermatozoïdes et la sélection d’un spermatozoïde ne présentant pas de vacuole céphalique en vue d’IMSI (Intra-cytoplasmic Morphologically-selected Sperm Injection) permet d’améliorer les taux de grossesse et de diminuer les fausses couches spontanées (Bartoov et al., 2002; Boitrelle et al., 2011, 2013). Les vacuoles sont en lien avec une noncondensation de la chromatine mais la nature des vacuoles spermatique reste peu connue (Boitrelle et al., 2011).

Résultats:
H3K4me3 est surexprimée et H3K27me3 sous-exprimée dans les spermatozoïdes vacuolés. Après reconstruction 3D par microscopie à sectionnement optique et déconvolution, on observe que la marque H3K4me3 est présente dans la vacuole (Figure 1). Ainsi, il existe un marquage épigénétique différentiel entre les spermatozoïdes vacuolés et non vacuolés.

Perspectives:
H3K4me3 a été décrite comme étant une marque activatrice qui décondense la chromatine afin de permettre l’accès à la machinerie de transcription. Au contraire, H3K27me3 a été décrite comme une marque répressive qui condense la chromatine et empêche l’accès à la machinerie de transcription (Hammoud et al., 2009). L’excès de H3K4me3 et le déficit de H3K27me3 dans les spermatozoïdes vacuolés indiquent que la chromatine de ce type de spermatozoïdes est globalement moins condensée que la chromatine des spermatozoïdes sans vacuoles. Ceci montre que la présence de vacuoles dans la tête du spermatozoïde est liée au degré de condensation de la chromatine et que les spermatozoïdes vacuolés auraient un défaut de maturité nucléaire. La localisation génomique des modifications d’histones H3K4me3 et H3K27me3 chez les patients présentant une expression différentielle de ces marques doit être étudiée.

Valorisation:
Communication orale ESHRE 2019
Publication écrite Cells 2022

Références bibliographiques:
- Bartoov, B., Berkovitz, A., Eltes, F., Kogosowski, A., Menezo, Y., & Barak, Y. (2002). Real- Time Fine
Morphology of Motile Human Sperm Cells is Associated With IVF-ICSI Outcome. Journal of Andrology,
23(1), 1‐8. https://doi.org/10.1002/j.1939- 4640.2002.tb02595.x
- Boitrelle, F., Ferfouri, F., Petit, J. M., Segretain, D., Tourain, C., Bergere, M., Bailly, M., Vialard, F.,
Albert, M., & Selva, J. (2011). Large human sperm vacuoles observed in motile spermatozoa under
high magnification : Nuclear thumbprints linked to failure of chromatin condensation. Human
Reproduction, 26(7), 1650‐1658. https://doi.org/10.1093/humrep/der129
- Boitrelle, F., Albert, M., Petit, J.-M., Ferfouri, F., Wainer, R., Bergere, M., Bailly, M., Vialard, F., & Selva,
J. (2013). Small human sperm vacuoles observed under high magnification are pocket-like nuclear
concavities linked to chromatin condensation failure. Reproductive BioMedicine Online, 27(2), 201‐
211. https://doi.org/10.1016/j.rbmo.2013.05.004
- Hammoud, S. S., Nix, D. A., Zhang, H., Purwar, J., Carrell, D. T., & Cairns, B. R. (2009). Distinctive
chromatin in human sperm packages genes for embryo development. Nature, 460(7254), 473‐478.
https://doi.org/10.1038/nature08162

 

 

Date de modification : 08 février 2024 | Date de création : 11 avril 2016 | Rédaction : Laurent M.